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多肽合成簡介導(dǎo)航關(guān)閉

多肽合成簡介

定義:

多肽是α-氨基酸 以肽鏈連接在一起而形成的 化合物。

分類:由兩個(gè)氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫做二 肽,同理類推還有三肽、四肽、五肽等。通常由10~100氨 基酸分子脫水縮合而成的化合物叫多肽。它們的分子量低 于10,000Da(Dalton道爾頓)。由2~10個(gè)氨基酸組成的 肽稱為寡肽(小分子肽);10~50個(gè)氨基酸組成的肽稱為 多肽;由50個(gè)以上的氨基酸組成的肽就稱為蛋白質(zhì)。

1902年

1902年

德國化學(xué)家費(fèi)雪

首先合成二肽,獲得諾1902貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

1906年

1906年

德國化學(xué)家費(fèi)雪

首次合成了18肽

1932年

1932年

馬克斯·伯格曼

在氨基酸保護(hù)基和縮合試劑方面有了些突破,極大的推動(dòng)了多肽化學(xué)研究。

1953年

1953年

美國人杜·維尼奧

首次合成多肽激素--催產(chǎn)素Oxytocin,獲得諾1955貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

1955年

1955年

英國人桑格

首次測定了胰島素的全部氨基酸序列,獲得了1958年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

1963年

1963年

美國人梅里菲爾德

提出了固相多肽合成方法(SPPS),這個(gè)在多肽化學(xué)上具有里程碑意義的合成方法, 獲得了1984年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

1965年

1965年

中國科學(xué)家

首次合成了牛胰島素。

1972年

1972年

卡皮諾

首先將9-芴甲氧羰基(FMOC)用于保護(hù)氨基,HATU為縮合試劑。

Polypeptide application
多肽應(yīng)用
多肽的合成方法有:

1、生物合成方法

2、酶催化合成法

3、化學(xué)合成方法(包含液相合成和固相合成)

多肽固相合成
定義:
從C端(羧基端)向N端(氨基端)重復(fù)添加氨基酸的過程。
設(shè)計(jì)方法:
先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸(C端)的羥基以共價(jià)鍵的結(jié)構(gòu)同一個(gè)不溶性的高分子樹脂相連,然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過脫去 氨基保護(hù)基并同過量的活化羧基組分反應(yīng),接長肽鏈。重復(fù)(縮合→洗滌→去保護(hù)→洗滌→下一輪縮合)操作,達(dá)到所要合成的肽鏈長度,最后將肽鏈從樹脂上裂解下來,經(jīng)過純化等處理,即得所要的多肽。
分類:
其中α-氨基用BOC(叔丁氧羰基)保護(hù)的稱為BOC固相合成法,α-氨基用FMOC(9-芴甲氧羰基)保護(hù)的稱為FMOC固相合成法,

樹脂選擇
固相合成中所使用的樹脂:
1、一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯,聚乙二醇包被聚苯乙烯(PEG-PS),聚丙烯酰胺三種材料,大小在75-150μm, 交聯(lián)度在1-2%之間,現(xiàn)在使用的大多是1%。因?yàn)檫@種交聯(lián) 度下,樹脂在DMF,DCM中具有很好的溶脹性能,立體上是一個(gè)空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),反應(yīng)物分子可以在樹脂內(nèi)部自由移動(dòng) 。
2、樹脂最關(guān)鍵的部分是連接手臂,它一端連接在樹脂上,一端作為反應(yīng)位點(diǎn)。
3、目前廣泛使用的樹脂有:wang,2-氯三苯基氯樹脂,Rink Amide AM Resin,Rink Amide MBHA Resin等。
常用催化試劑
Common catalytic reagents

 
茚三酮檢測:

固相多肽合成中,主要是通過檢測樹脂上游離氨基來判斷連接效率,檢測方法稱為Kaiser方法,其檢測結(jié)果,如果有游離氨基的時(shí)候,顯示蘭色,或紅褐色(pro,ser,His)。

Kaiser試劑包括:

A,5%茚三酮的乙醇溶液

B,80%苯酚的乙醇溶液

C,2%0.001M KCN的吡啶溶液

配制中的吡啶需要經(jīng)過茚三酮處理后,重蒸后再使用。檢測過程,取少量樹脂,加入A,B,C各2-3滴,105-110℃下加熱5min,如果溶液有蘭色,或樹脂出現(xiàn)蘭色,紅褐色,表明還有游離氨基,否則說明連接完全。

SPPS過程簡介
SPPs process introduction

過程簡介
【·】對(duì)于生成肽酰胺的樹脂,如Rink-Amide-AM,MBHA樹脂。其連接條件同多肽偶合條件,一般采用HBTU/HOBt/DIEA,DIC/HOBt等。
【·】對(duì)于羥甲基樹脂,如Wang,PAM,HMBA,采用DCC/DMAP方法連接,未反應(yīng)的羥基,用醋酸酐/吡啶/DMAP封閉。
【·】對(duì)于2-Cl-Trt樹脂,反應(yīng)條件非常簡單,只須在氨基酸溶 液中加入2-3當(dāng)量的DIEA,而且該反應(yīng)速度快,一般30min 就完成反應(yīng),反應(yīng)后用MeOH/DIEA封閉。需要注意的是該樹脂對(duì)酸特別敏感。
縮合反應(yīng)
副反應(yīng)
氨基酸消旋
氨基酸消旋與氨基酸種類以及反應(yīng)條件有關(guān)系,比較容易發(fā)生消旋的氨基酸有Phe,Cys,His。但是如果采用合適的縮合試劑以及反應(yīng)條件,可以將氨基 酸消旋控制在很低的水平。
氧化
氧化反應(yīng)主要發(fā)生在序列中Met,Cys,Trp,Tyr等幾個(gè)氨基酸。但是由于Cys,Trp,Tyr在合成中側(cè)鏈都是保護(hù)的,只有Met一般是不保護(hù)的,因此,對(duì)于含有Met的多肽序列,要避免長時(shí)間在空氣流中。Met氧化成為Met(O) 后,可以通過在切割過程中加入Me2S,將其還原。二酮哌嗪(DKP)反應(yīng)
DKP反應(yīng)
發(fā)生在Wang樹脂,而且C端氨基酸為Pro的時(shí)候,當(dāng)?shù)诙€(gè)氨基酸脫Fmoc的條件下,發(fā)生該副反應(yīng),反應(yīng)極其迅速。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)氨基酸為Gly,Ser的時(shí)候,也可能發(fā)生。
固相合成多肽裂解
裂解及側(cè)鏈保護(hù)基脫除:
Fmoc法裂解和脫側(cè)鏈保 護(hù)基時(shí)可采用強(qiáng)酸.TFA為應(yīng)用最廣泛的強(qiáng)酸試劑。